猴痘病毒（MPXV）的基因組分析

猴痘病毒（MPV）屬于痘病毒科正痘病毒屬，可引起一種類(lèi)似于天花的人類(lèi)疾病。對(duì)MPV基因組196858bp進(jìn)行了結(jié)構(gòu)特征和開(kāi)放閱讀框分析，基因組的每一端都包含一個(gè)完全相同但方向相反的長(zhǎng)為6379bp的末端反向重復(fù)序列、一個(gè)假定的端粒分辨序列和短串聯(lián)重復(fù)序列。MPV包含已知正痘病毒的基本基因，但只包含免疫調(diào)節(jié)和宿主范圍基因的一個(gè)子集。序列比較證實(shí)MPV是一種獨(dú)特的正痘病毒，不是天花病毒的直系祖先或直系后代。

1. 簡(jiǎn)介

痘病毒科由復(fù)雜的雙鏈DNA病毒組成，其特點(diǎn)是在脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制。痘病毒屬于正痘病毒屬，包括天花病毒（VAR）、猴痘病毒（MPV）、牛痘病毒（CPV）和痘苗病毒（VAC）。VAR是人類(lèi)天花的病原體，天花是一種死亡率為10%-40%的傳染病，通過(guò)活體VAC預(yù)防性接種戰(zhàn)略性消除了天花。根除天花后，停止接種疫苗，導(dǎo)致對(duì)其他正痘病毒的免疫力下降。因此，現(xiàn)在人們對(duì)MPV、CPV和VAC等人畜共患病毒的易感性增加。這些病毒在人群中潛在傳播可能導(dǎo)致其致病性或傳染性的適應(yīng)性增加。

猴痘和天花的相似臨床表現(xiàn)導(dǎo)致了MPV是VAR進(jìn)化祖先的假說(shuō)。根據(jù)基因組限制性內(nèi)切酶圖譜或單個(gè)病毒基因的核苷酸序列比較VAR和MPV分析MPV和VAR的進(jìn)化圖譜。對(duì)人類(lèi)MPV分離株ZAI-96-I-16 （MPV- ZAI）進(jìn)行了DNA測(cè)序，通過(guò)比較全基因組，得出結(jié)論：MPV不是VAR的直系祖先或后代。對(duì)MPV-ZAI的DNA序列進(jìn)行了詳細(xì)分析，并與VAC、VAR相應(yīng)的全基因組序列和CPV的部分序列進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)該序列包括除部分共價(jià)末端發(fā)夾環(huán)外的整個(gè)基因組。

2. 基因組圖譜

正痘病毒基因組的末端包含一個(gè)完全相同但方向相反的序列，稱為末端反向重復(fù)序列（ITR），其中包括一組短串聯(lián)重復(fù)序列和末端發(fā)夾。MPV-ZAI基因組包含一個(gè)6379bp的ITR。通過(guò)S1核酸酶水解和DNA聚合酶Ⅰ聚合，成功克隆了MPV-ZAI DNA中兩條互補(bǔ)的、不完全堿基配對(duì)的發(fā)夾環(huán)鏈之一。該序列與其他正痘病毒的序列比對(duì)表明，該序列具有相當(dāng)大的保守性，并只缺失組成環(huán)的四個(gè)核苷酸（圖1）。

圖1. MPV與其他正痘病毒末端區(qū)域的比較

注釋：上行顯示了MPV-ZAI終端循環(huán)的排序部分。核苷酸與VAC-WR序列不同。ZAI、BSH和WR分別代表Zaire-96-I-16、孟加拉國(guó)和西部保護(hù)區(qū)的病毒株。

MPV的端粒解析序列與VAC、VAR相同。MPV-ZAI基因組末端發(fā)夾附近的串聯(lián)重復(fù)序列區(qū)域較短，由NR Ⅰ（85bp）和NR Ⅱ（322bp）組成。MPV-ZAI DNA這一區(qū)域的組織結(jié)構(gòu)與VAR-GAR最相似（圖2）。然而所有VAR毒株的末端區(qū)域都有非常短的ITR，缺少ORF，并且左右末端的重復(fù)序列集不同。

圖2. MPV和其他正痘病毒ITR區(qū)域內(nèi)串聯(lián)重復(fù)模式

注釋：白色矩形表示獨(dú)特的ITR序列：NR I和NR II以及編碼區(qū)。黑色菱形對(duì)應(yīng)于70個(gè)堿基的串聯(lián)重復(fù)序列，其數(shù)量如上所示。灰色三角形對(duì)應(yīng)于54個(gè)堿基的重復(fù)序列，其數(shù)量如下所示。VAc-COP和VAc-WR ITR序列中的五邊形表示125個(gè)堿基的重復(fù)。開(kāi)放的方塊和三角形表明，這些重復(fù)序列通過(guò)刪除、替換或插入而不同于共識(shí)序列。黑色的圓圈表示末端的發(fā)夾。虛線表示缺少相應(yīng)的DNA。

3. 編碼區(qū)

MPV-ZAI基因組左側(cè)的四個(gè)ORF（圖3A）位于ITR內(nèi)，因此在基因組右側(cè)也有對(duì)應(yīng)的ORF（圖3B）。所有已知在其他正痘病毒中至關(guān)重要的基因都存在于MPV中，并占據(jù)基因組的中心區(qū)域（ORFs C10L到A25R）。這些ORF與其他正痘病毒的序列同源性大于90%。MPV-ZAI與正痘病毒之間的大多數(shù)物種和毒株特異性差異存在于左側(cè)和右側(cè)的末端區(qū)域（圖3A和圖3B）。MPV-ZAI缺少CPV-GRI中發(fā)現(xiàn)的25個(gè)ORF和VAR-IND的19個(gè)潛在ORF。雖然其中一些基因的作用仍然未知，但它們可能包括許多涉及免疫逃避、宿主范圍和細(xì)胞增殖的基因。

圖3. MPV左側(cè)(A)和右側(cè)(B)末端可變區(qū)內(nèi)的ORF與其他正痘病毒相應(yīng)基因組片段的比對(duì)

注釋：ORF的大小和方向用箭頭標(biāo)出。一種病毒的DNA和蛋白質(zhì)相對(duì)于另一種病毒的缺失，分別超過(guò)150bp和50個(gè)氨基酸，用圓點(diǎn)標(biāo)記。黑色方塊標(biāo)記ITR區(qū)域內(nèi)的序列。核苷酸編號(hào)顯示在右邊。

之前比較了MPV和VAR兩類(lèi)基因，在表1. 中添加了VAC和CPV的生長(zhǎng)因子和免疫逃避基因，后者包含了正痘病毒中存在的所有此類(lèi)已知基因。根據(jù)完整且未被廣泛截?cái)嗟亩玖虻臄?shù)量（括號(hào)中所示），得到：CPV-GRI（17）＞VAR-IND（11）=VAR-GAR（11）＞MPV-ZAI（10）＞VAC-COP（9）＞VAC-MVA（6）。因此，MPV-ZAI也比CPV含有更少的錨蛋白重復(fù)基因。

注釋：*表示在左側(cè)和右側(cè)反向末端重復(fù)區(qū)域（ITR）中復(fù)制的ORF。與CPV-GRI的相應(yīng)ORF在功能上有重要差異的ORF用?表示。

CPV-GRI編碼Kelch族6-500個(gè)功能未知的氨基酸，彼此之間的相似性為22-26%。雖然VAC-COP編碼3個(gè)Kelch族蛋白，與CPV-GRI蛋白同源性分別為99.4%、97.9%和98.6%，但MPV-ZAI基因組只編碼1個(gè)C9L，與CPV-GRI蛋白G3L同源性為97.3%。在VAR的基因組中，這些ORF似乎都被破壞了，這表明它們?cè)趶?fù)制中不是必需的。

VAC含有兩個(gè)帶有磷脂酶D序列的ORF：F13L是形成細(xì)胞外病毒和有效的細(xì)胞間感染傳播所必需的，而K4L對(duì)于組織培養(yǎng)中的復(fù)制是必不可少的。MPV-ZAI包含這三個(gè)ORF的完整版本（C4L、C5L和C19L），而VAR株由于DNA片段的缺失而缺乏C4L和C5L同源物（圖3A）。C4L和C5L蛋白的功能尚不清楚，但它們都是由MPV和CPV這兩種正痘病毒編碼的且宿主范圍相對(duì)較廣。

4. 系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)末端可變區(qū)DNA序列，認(rèn)為CPV的組織結(jié)構(gòu)與祖先的正痘病毒種類(lèi)最為相似，VAR與MPV的距離比VAC的略遠(yuǎn)。然而，通過(guò)分別分析左側(cè)和右側(cè)的可變區(qū)，情況似乎更加復(fù)雜。VAC毒株似乎比他們的左側(cè)更接近MPV-ZAI末端可變區(qū)和VAR菌株相對(duì)于右側(cè)末端可變區(qū)（圖4），這種差異可能是由于VAC的復(fù)雜重組起源引起的。

圖4. 系統(tǒng)發(fā)育分析

5. 總結(jié)

綜上所述，MPV的基因組似乎是典型的正痘病毒，它包括一個(gè)中央保守區(qū)，更多可變的左端和右端區(qū)域，以及一個(gè)具有串聯(lián)重復(fù)的ITR。對(duì)MPV、VAR、CPV和VAC基因組的比較分析證實(shí)，MPV是一個(gè)離散的物種，表現(xiàn)出與其他致病的正痘病毒的多種不同。由于VAC有復(fù)雜重組的起源，所以物種之間的重組是可能的，正痘病毒很可能是從類(lèi)似牛痘的祖先病毒獨(dú)立進(jìn)化而來(lái)。

參考文獻(xiàn)

Shchelkunov SN, Totmenin AV, Safronov PF, et al. Analysis of the monkeypox virus genome[J].?Virology. 2002, 297(2): 172-194.

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